荧光检测知识普及原理

很多细胞实验都要检测荧光，为方便大家选择合适的方法，在此简单说一下各种荧光检测方法的特点。不足的地方，欢迎大家补充：

1、流式，优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，*不用担心荧光淬灭的问题。缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。

2、荧光显微镜，刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。

3、共聚焦，荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。另外，4Pi和STED又是其中的极，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。

4、全内反射，荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且合做膜研究，无法看到胞内信息。也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。

5、双光子，另一种共聚焦，因使用长波激发荧光，故能做深层检测（突破共聚焦的100微米极限），典型的应用是观察活体脑组织。巨贵无比，国内没有几台，能用上的人不多——就不说了。

6、新推出的高内涵药筛系统，流式和显微镜的杂合体，使用电动载物台，可以自动地按预定程序完成实验，可做大流量检测（虽然速度慢点），而且有成像能力，可以判断定位。前段时间，国内哪装了一台，很多人在吹，但我实在不知道其中的好处——任何一台带电动载物台的显微镜都可以达到相似的效果，只要软件支持——估计有人赚大发啦！

从以上的简介可以看出，只要是荧光样品，就应该都可使用以上仪器检测（只用TIRF受一些限制）。但是实际应用时，大家可能会碰到某些样品可以使用流式和显微镜，但是无法使用共聚焦。为什么？解释一下：

首先，荧光检测必须有激发光照明，染料被特定波长的光照射以后才能发射荧光。激发光源有两种：1）白光（汞灯、氙灯等），然后通过滤光片选择只通过特定波长的光。如检测GFP时，大家能看到蓝光照射在样品上，因为GFP的激发条件是488nm 光。但是有一点，显微镜不可能装无限多的滤光片，所以选择是有限的。2）激光，普通的激光器只能发射特定波长的光，且数量有限，常见的是405、488、514、543、633等，所以可使用的染料也是有限。因此，大家判定仪器能否满足你实验要求，务必先看看激发条件是否合适。

其次，在光检测器（PMT、CCD)前还有一块滤光片，作用是反射样品各种散射光，只通过特定波长的荧光，提高信噪比，得到干净的背景。因此，这块滤光片也决定了仪器能否满足你的实验要求（不用太担心，这个一般和激发滤光片配套，不会有太多问题）。而在光谱型共聚焦里，使用的是棱镜或衍射光栅分光，可以选择通过任意需要的波段。这对使用量子点做标记的同学特别有好处！